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       在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧ｋp重免疫熒光標(biāo)記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。 

標(biāo)本要求：

切片、爬片 

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟 

1、冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復(fù)溫，晾干水分，冷B酮固定10min，待B酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脫色 搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。 

2、修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。 3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上 晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。 

3、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn) 用），加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。 

4、BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室 溫封閉30min。 

5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少 量水防止抗體蒸發(fā)） 

6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬 的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。 

7、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育 10min。 

8、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光 激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm） 

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I15-20min-二甲苯II15-20min-無水乙醇I10min-無水乙醇II10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗(冬天脫蠟時(shí)間稍微延長)。

2、 修復(fù):切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走)，在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋)覆蓋  組織，37度溫箱解育30min，將玻片置干PBS(PH7.4)中在脫色搖床上異動(dòng)洗滌3次，每次5min

3、破膜:切片稍甩干后在圓內(nèi)滴加破膜工作液要蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min

4. 加試劑1.2:按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內(nèi)要蓋組織。切片平放干混盒內(nèi)，37°C恒濕箱解音2小時(shí)，混盒內(nèi)加少墨水保持溫度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室 溫封閉30min

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少 量水防止抗體蒸發(fā)） 

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬 的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。 

8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育 10min。 

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光 激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm） 

注意事項(xiàng) 

1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長，可能會(huì)使熒光提前衰退。 

2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對照： 

(1)陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物; 

(2)陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物; 

(3)熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物。

服務(wù)圖片案例

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果： 

歡迎咨詢詳談，我們會(huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。 

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